Научное изыскательское исследование

1.1.2.Возможности повышение устойчивости организма к мутагенным

воздействиям

Ключевым фактором в определении устойчивости клеток организма к мутагенным и генотоксическим воздействиям может быть питание. Оно определяет важные метаболитические и детоксицирующие реакции: то есть подверженность клеток влиянию канцирогенных веществ, поступающих в организм, их детоксикацию/активацию, восстановление ДНК, синтез и репарацию ДНК и т.п. Многие микроэлементы действуют как сопутствующие факторы в реакциях поддержания целостности ДНК. Недостаточные уровни содержания в клетке основных микроэлементов приводят к ослабеванию активности ферментов, требуемой для поддержания геномной стабильности, что приводит к увеличению спонтанного и индуцированного мутирования [93, 72, 41, 50, 88].

Примерно 40 микроэлементов (витаминов, минеральных веществ и других эссенциальных соединений) обязательно должны присутствовать в пищевом рационе человека, причем, в строго определенных количествах для обеспечения равновесия в процессах метаболизма [117]. Недостаток даже одного из соединений приводит к искажению метаболитических реакций, что может привести к эндогенным повреждениям ДНК. Однако, оптимальная ежедневная норма потребления микроэлементов для поддержания генетической стабильности неизвестна. Рекомендуемая норма потребления (РНП), разработанная специалистами лечебно-профилактического питания, основывается на результатах изучения сиюминутного влияния соединений на организм человека [136]. Оптимальная доза приема микроэлементов для поддержания геномной стабильности может колебаться в зависимости от возраста, генной конституции, социальных факторов, а также на нее могут оказывать влияние другие компоненты питания [40]. Определение оптимального количества микроэлементов и коррекция их недостаточности для поддержания генетической стабильности на сегодня является актуальной, но мало разработанной проблемой.

Недостаточность таких микроэлементов как фолиевая кислота, витамины В12, В6, С, Е, ниацин, железо и цинк вызывает хромосомные повреждения, связанные с одно- или двунитевыми разрывами в ДНК. Эти нарушения являются факторами, приводящими к возникновению кардиоваскулярных и онкозаболеваний у человека [48]. В таблице 1 приведены данные, отражающие связь между недостатком в питании основных нутриентов, повреждением ДНК и возникновением различных заболеваний [136].

Селен

Таблица 1. Недостаточность некоторых микроэлементов и

Микроэлементы	Повреждение ДНК	Манифестирующие патологии
Фолиевая кислота	Разрывы хромосом	Рак толстой кишки; сердечно-сосудистые болезни; дисфункция мозга; врожденные дефекты развития
Витамин В12	Разрывы хромосом	Повреждение, нервных тканей; см. фолиевая кислота
Витамин В6 Разрывы хромосом См. фолиевая кислота
Витамин С	Окисление ДНК	Катаракта 4Х; рак; сердечные болезни
Витамин Е	Окисление ДНК	Рак толстой кишки; сердечно-сосудистые болезни; иммунная дисфункция
Железо	Разрывы ДНК	Дисфункция мозга; иммунная дисфункция; рак
Цинк	Разрывы хромосом	Дисфункция мозга; иммунная дисфункция; рак
Ниацин	Невозможность восстановления ДНК, (полиАДР-рибоза)	Неврологические симптомы; потеря памяти

Рак простаты

Ames B.N. [39, 40] полагает, что существует взаимозависимость между наиболее часто встречающимися у человека дефицитами микроэлементов и возросшим увеличением раковых заболеваний. Например, включение урацила в ДНК, вызванное низким потреблением фолитов, и окисление ДНК-оснований, вызванное низким содержанием антиоксидантов в пище, может независимо, или в совокупности вызвать повреждения ДНК. Последнее исследование, показывающее возрастание риска рака груди у тех, у кого наблюдается полиморфизм в МпСОД (фермент супероксиддисмутаза) и недостаточное потребление в пище антиоксидантов, еще более обращает внимание на важность проблемы взаимодействия на уровне пища - генная структура [38].

Доказательства роли микроэлементов в различных аспектах поддержания ДНК, помощи в предотвращении рака, сердечных болезней, синдрома Альцгеймера и преждевременного старения, и их роль в поддержании геномной стабильности были получены путем экспериментов на млекопитающих и на человеке, в обоих случаях использовались культуры in vitro и подходы in vivo. Эффективность и необходимая дозировка таких добавок представляется важным направлением исследований фармакогенетики [64, 138, 103, 124, 38].

Рекомендуемая диетическая норма (РДН) микроэлементов традиционно устанавливалась на таких уровнях, которые были необходимы для предотвращения симптомов витаминной недостаточности. Однако, есть много оснований полагать, что более высокие уровни присутствия в организме некоторых биологически активных веществ могут быть необходимы для обеспечения процессов, поддерживающих целостность ДНК, и, следовательно, потребление микроэлементов в рекомендованных РДН дозах может быть недостаточным для обеспечения стабильности генома. Дополнения к обычному рациону питания в виде препаратов витаминов и/или минералов, или отдельных растительных полифенолов становятся все более распространенными среди большой части населения. Однако не существует жесткой нормы по поводу количественного потребления подобных добавок, генотипические индивидуальные различия также не принимаются в расчет.

Теоретическое определение оптимального уровня приема витаминов и минералов в целях поддержания геномной стабильности будет способствовать созданию надежных рекомендаций, нацеленных на профилактику так называемых дегенеративных болезней, вызванных повреждением ДНК. Концепция РДН, направленная на поддержание геномной стабильности, содержит новый подход к определению пищевого рациона, который помог бы предотвратить болезни, вызванные повреждением ДНК [71].

1.1.2.1. Витамины и другие биологически активные вещества органического происхождения как факторы поддержания стабильности

генома

Эпидемиологические данные свидетельствуют, что прием пищи, богатой витамином С, связан с сокращением риска сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических заболеваний и разных видов рака [79]. В своем исследовании Halliwell B. указывает, что в настоящее время недостаточно проверенных данных, касающихся прооксидантного эффекта витамина С в дозах, превышающих РДН. Однако автор предполагает наличие у данного вещества способности обеспечивать стабильность генных структур именно из-за его антиканцерогенных качеств [79].

Витамин Е - другой витамин антиоксидант, играющий важную роль в предотвращении переокисления липидов. Claycombe R.J. и Meydani S.N. в своем исследовании показали, что витамин Е играет защитную роль против повреждения хромосом и окисления ДНК. Однако только у одного из пяти участников исследования наблюдалось уменьшение повреждения ДНК после дополнительного приема витамина Е [54].

Ниацин - один из немногих витаминов, который выполняет хорошо изученную роль в синтезе ДНК, восстановлении ДНК и гибели клетки. Ниацин - предшественник НАД+, который требуется как субстрат для поли(АБР-рибозы)-полимеразы-1 (PARP). PARP играет решающую роль при восстановлении разрывов в цепи ДНК и при инициации клеточной реакции на повреждение ДНК. Статус ниацина или активность PARP может сыграть решающую роль в определении, может ли клетка, в которой произошло разрушение ДНК, восстановиться или погибнуть. Hageman G.J. и Steirum R.H. в своем исследовании, посвященном определению воздействия добавочного ниацина на человека in vivo, не выявили надежных результатов, которые могли бы определить оптимальную дозу приема этого витамина, но подтвердили его существенную роль в обеспечении стабильности генома

[78].

Фолиевая кислота - второй витамин, который играет решающую роль в предупреждении включения урацила в ДНК (что ведет к повреждению хромосом) и гипометиляции ДНК. Было показано, что нехватка как фолиевой кислоты, так и витамина В12, вызывает повреждение хромосом и формирование микроядер у человека in vivo. В своем исследовании о влиянии на человека этих двух витаминов in vivo Fenech М.[2001] приходит к выводу, что прием избытка (200 мг) фолиевой кислоты и (2 мг) витамина В12 снижает уровень повреждений хромосом [73]. Исследования Skibola C.J. et al.[1999] и Ames B.N [1999] показали, что оптимальная доза приема с пищей для поддержания геномной стабильности данных микроэлементов зависит от возраста и генотипа [39, 127]. Возрастной фактор особенно важен для фолиевой кислоты и витамина В12, потому что способность всасывания этих витаминов заметно снижается с возрастом.

Список микроэлементов, играющих важную роль в метаболизме ДНК, все возрастает, и одним из последних в него добавился витамин Д. Chaatterjee М. указывает на роль этого соединения в регуляции экспрессии онкогенов, синтеза кальциево-связанных протеинов, а также отмечает антиоксидантную активность витамина Д и его значение для регуляции уровней эндогенных антимутагенов глютатиона и полиаминов в здоровых клетках и процессов апоптоза раковых клеток. Chatterjee M. заключает, что принятая в данное время РДН - 5мг в день - недостаточна для некоторых людей, и рекомендует пересмотр последней, с учетом возможной роли витамина в профилактике раковых заболеваний [53].

Растительные полифенолы - постоянно присутствуют в пищевом рационе. Они играют решающую роль в модифицировании генной экспрессии, антиоксидантного статуса и, соответственно, риска раковых и сердечно-сосудистых заболеваний у человека. Ferguson L.R. [2001] объясняет биологическую активность различных растительных полифенолов их способностью вызывать и/или предотвращать повреждение ДНК [74].

В группу полифенолов входят флавоноиды, танины, катехины. Большинство сведений о влиянии флавоноидов и других полифенолов на спонтанный и индуцированный мутагенез было получено в экспериментах на микроорганизмах. Исследований, выполненных in vivo или in vitro на эукариотических клетках, особенно ценных с точки зрения экстраполяции на человека, немного. Галангин в экспериментах in vivo и in vitro снижал кластогенный эффект блеомицина в клетках мышей [84], а также уменьшал образование микроядер под влиянием митомицина С в ретикулоцитах периферической крови мышей [85]. Повреждающее ДНК действие блеомицина усиливалось под влиянием кверцетина, мирицитина, госсипола. В то же время госсипол ингибировал индукцию микроядер, образующихся в половых клетках самцов мышей под действием нитрозометилмочевины и фотрина [22]. Также ранее было показано, что рутин и комплекс солей флавоноидов шлемника байкальского с аминокислотами уменьшают кластогенное действие хризотил-асбеста и цеолита в культуре клеток человека. Кроме того, флавоноиды обладали аналогичной активностью по отношению к диоксидину [18]. Однако сегодня, по мнению Ferguson L.R., еще недостаточно данных, чтобы было возможно рекомендовать прием флавоноидов с целью предотвращения мутагенеза [74].

1.1.2.2. Минеральные вещества и их роль в антимутагенной защите организма

Селен рассматривается в качестве важного компонента пищи, играющего ведущую роль в регуляции мутагенеза и канцерогенеза. El-

Bayoumy K. показано, что селенит натрия ингибирует мутагенное действие N- нитрозо-2-ацетиламинофлуорена, регистрируемое методами учета СХО и хромосомных аберраций в культуре клеток китайского хомячка [69]. В то же время другими авторами было показано, что селен обладает мутагенными свойствами и способен усиливать действие ряда химических мутагенов in vivo и in vitro [47].

Медь является кофактором многих ферментов, цитохромов, супероксиддисмутазы Cu/Zn [95], регулирующих реакции окисления-восстановления. Человеку рекомендуется принимать 1 - 3 мг меди в день, и предполагается, что такой дозы достаточно для поддержания стабильности генома. Прием больших доз этого элемента принципиально может привести к геномной нестабильности за счет усиления прооксидантных реакций, однако, существует гомеостатический контроль уровня меди в плазме крови

[94].

Железо, подобно меди, также вовлечено в прооксидантные реакции, и его высокий уровень, скорее всего, усиливает окислительные процессы [63]. Клетки и живые организмы имеют механизмы уменьшения концентрации ионов железа, например, регулируемую межмембранную транспортировку ионов этого металла. Кроме того, существенную роль в предотвращении его негативных эффектов играют ферменты, утилизирующие оксиданты, возникающие при участии железа [63].

Цинк - активный центр фермента супероксиддисмутазы, и это определяет его роль в предупреждении эндогенных и экзогенных повреждений генома, опосредованных через интенсификацию образования АФК и ПОЛ. Однако, уровень его оптимального с точки зрения генетической стабильности поступления в организм еще не определен [65].

Таким образом, на сегодня имеется большое количество сведений о влиянии диетических факторов на генную стабильность, однако их количество и качество недостаточно для того, чтобы окончательно определить необходимый для поддержания здоровья человека уровень поступления того или иного микроэлемента или их комплексов. Пробелы в знаниях по этим вопросам могут быть ликвидированы только путем проведения соответствующих экспериментов с различными типами пищевых ингибиторов мутагенеза, что приведет к более глубокому пониманию связей между концентрацией микроэлементов и повреждением ДНК.

1.1.3. Фармакологическая защита генома

Наиболее продвинутым направлением в области антимутагенной защиты организма человека является разработка фармакологических средств защиты генома.

На сегодня имеется достаточно большое сведений о соединениях различной природы, способных в условиях эксперимента снижать или подавлять индуцированный мутагенез. Антимутагенные свойства в различных тест-системах демонстрируют фармакологические средства различного назначения, такие как бензодиазепиновые транквилизаторы (диазепам, феназепам и другие), актопротекторы - производные 2-меркаптобензимидазола (бемитил и другие), сульфаниламиды (стрептоцид, норсульфазол и другие), индукторы синтеза эндогенных интерферонов, соединения, являющиеся производными 1,4 -дигидропирина, 3-оксипиридина, дигидрохинона, фенотиазина, а также тиреоидные гормоны [1, 11, 21, 18, 80, 81, 75]. Эти антимутагены по своим физико-химическим характеристикам и функциональным назначениям весьма различны и имеют разные механизмы действия антимутагенной защиты.

Среди соединений психотропного ряда и актопротекторов, диазепам вызывал снижение хромосомных аберраций, индуцированных циклофосфаном, в клетках костного мозга мышей, проявляя тем самым антимутагенные свойства. Феназепам предотвращал цитогенетические последствия эмоционального стресса, снижал выход генных мутаций, индуцируемых фопурином у дрозофилы, редуцировал уровень хромосомных аберраций, индуцированных фотрином и фопурином в клетках костного мозга мышей [17].

Актопротектор бемитил, снижающий потребление кислорода клетками [2] и антигипоксант томерзол также продемонстрировали в разных тест-системах антимутагенные свойства [17]. По мнению авторов, антимутагенная активность этих соединений сопряжена с их антирадикальными свойствами. Этими же авторами описаны антимутагенные свойства производного 3-оксипиридина мексидола. В культуре цельной крови человека мексидол ослабляет цитогенетический эффект фотрина, но усиливает цитогенетический эффект диоксидина. По отношению к алкилирующим агентам фотрину и фопурину антимутагенные свойства мексидола были подтверждены в экспериментах на мышах.

Фармакологические средства защиты генома обладают высокой специфичностью и за счет этого большой эффективностью. Так, в ряде случаев удается полностью устранить мутагенное действие ксенобиотиков [17, 12]. Использование антимутагенных компонентов в составе лекарственных форм позволяет разрабатывать генетически безопасные лекарства на основе потенциально мутагенных субстанций. Например, лекарственная форма фурадонина в отличии от нативной субстанции не обладает мутагенными свойствами из-за протекторного эффекта глицирама, входящего в ее состав [17].

Однако, применение фармакологических антимутагенов осложнено ограниченной возможностью их назначения здоровым людям для профилактики вероятностных последствий индуцированного мутагенеза.

В этом случае целесообразнее применение веществ <двойного назначения>, то есть антимутагенных соединений, которые можно использовать одновременно в качестве лекарств и пищевых добавок лечебно-профилактической направленности. Особое внимание в этой связи привлекают такие соединения как каротиноиды, аспартам и некоторые другие пищевые добавки. В рамках настоящей работы важно подчеркнуть, что часто вещества двойного назначения, в том числе и упомянутые аспартам и бета-каротин употребляются в качестве вспомогательных в составе лекарственных форм. Пример успешного совместного использования глицирама и фурадонина указывает на перспективу использования с аналогичной целью указанных соединений.

1.2. Основные группы антимутагенов и механизм их действия.

Наиболее полная классификация антимутагенов в соответствии с предполагаемым механизмом их действия предложена в работе S. De Flora и C. Ramel и представлена в таблице 2 [61].


защищающие агенты
2. Внутриклеточные механизмы
2.1. Стимуляция захвата и N-ацетил-Ь-цистеин в эритроцитах и детоксикации клетками, не легочных макрофагах являющимися мишенью мутагена
2.2. Модификация трансмембранного переноса
2.2.1. Ингибирование проникновения короткоцепочечные жирные кислоты, в клетку путресцин, ароматические аминокислоты, ацилгликозилстероиды, кальций
2.2.2. Стимулирование удаления из клетки	возможные модуляторы множественной лекарственной устойчивости
2.3. Модуляция метаболизма
2.3.1. Ингибирование активации промутагенов в первой фазе метаболизма	фенолы, арилалкилизотиоцианаты, индолы, моноциклические монотерпеноиды, ретиноиды, флавоноиды, никотинамид, короткоцепочечные жирные кислоты, гемин, хлорофиллин, дисульфирам, диэтилтиокарбомат, бета-каротин
2.3.2. Индукция детоксикации в первой фазе и конъюгации во второй фазе метаболизма или ускорение инактивации реакционноспособных метаболитов	олтипраз и другие дитиолтионы, фенолы, N-ацетил-Ь-цистеин, индолы, изотиоцианаты и др.
2.3.3. Повышение эффективности детоксикации	N-ацетил-Ь-цистеин, индол-3-карбинол
2.4. Блокирование взаимодействия с мишенью
2.4.1.Взаимодействие с электрофилами	N-ацетил-Ь-цистеин и другие тиолы, олтипраз, тиосульфат натрия, эрготионины, полифенолы, креатинин, никотинамид, гемин, хлорофиллин
2.4.2. За счет антиоксидантной активности и перехвата свободных радикалов	бета-каротин, аскорбат, альфа-токоферол, селен, тиопролин, эрготионеин, мочевая кислота, дитерпены, полифенолы, флавоноиды, N-ацетил-Ь-цистеин и другие тиолы, нестероидные противовоспалительные лекарства, ингибиторы синтеза
	простогландина Е2, индукторы
	антиоксидантных ферментов
	(протеинкиназа С и др).
2.4.3. Защита нуклеофильных	полиамины, ретиноиды
участков ДНК	полиамины, ретиноиды
2.5. Ингибирование клеточной ретиноиды, глюкокортикоиды,
репликации	изотиоцианы, тамоксифен, органические
	и неорганические соединения селена,
	кальций и др.
2.6. Модуляция метаболизма и репарации ДНК
2.6.1. Увеличение точности	хлорид кобальта, арсенит натрия,
репликации и репарации ДНК	ингибиторы топоизомераз
2.6.2. Стимуляция репарации и	циннамальдегид, кумарин, ванилин,
восстановления повреждений ДНК	амбеллиферон, таниновая кислота
2.6.3. Ингибирование ошибочной	ингибиторы протеаз, пара-
репарации	аминобензойная кислота
2.6.4. Коррекция гипометилирования	фолиевая кислота, метионин.

1.2.1. Каротиноиды

1.2.1.1. Биологические и фармакологические свойства

каротиноидов

Каротиноиды - природные пигменты, синтезируемые микроорганизмами и растениями, представлены во многих фруктах и овощах. На сегодня известно около 1000 представителей каротиноидных пигментов, из которых более 600 структурно идентифицированы [86]. Каротиноиды - это 40-углеродные молекулы, двучленные, с симметрично соединенными полиметилбутадиенами, чья совокупность сопряженных двойных цепей делает их исключительно эффективными при инактивации свободных радикалов и придает им антиоксидантные свойства. Некоторые каротиноиды (включая каротины) являются провитаминами - предшественниками одного из основных микронутриентов - ретинола (витамин А).

Антиоксидантные свойства каротиноидов были показаны разными способами в системах in vitro [126].

У человека уровень каротиноидов в крови зависит от их количества в пище, а концентрация ретинола - нет, поскольку витамин депонируется в печени. По концентрации каротиноидов в крови можно судить об обеспеченности ими организма, которая зависит от степени биодоступности каротиноидов. У людей обнаружены значительные индивидуальные различия в уровне бета-каротина в плазме крови, как до, так и после приема каротинсодержащих препаратов [51, 70, 34, 49, 131]. Выявлены возрастные, половые и региональные различия уровня бета-каротина в плазме крови людей, а также установлено, что этот показатель значительно ниже у курящих, алкоголиков, онкологических и кардиологических больных.[108,

128].

Антиоксидантная и провитаминная активности каротиноидов определяют такие их биологические функции и фармакологические свойства, как ингибирование канцерогенеза, возрастных изменений, предотвращение развития катаракты, радиационных поражений, сердечно - сосудистых заболеваний [23, 60, 76, 87, 99].

R. G. Culter [1984], выдвинув теорию о том, что длительность жизни различных индивидуумов может определяться теми же факторами, что и чувствительность к раку, показал, что имеется положительная корреляция между уровнем бета-каротина в плазме крови (но не ретинола) и продолжительностью жизни приматов [58].

1.2.1.2. Антимутагенные свойства каротиноидов и их влияние на

повреждение и восстановление ДНК

В настоящее время имеется ряд исследований, демонстрирующих антимутагенные свойства каротиноидов, главным образом, на примере изучениябета-каротина[36, 44, 45, 59, 97, 113, 119, 120, 121, 129].

Влияние каротиноидов на целостность ДНК исследовалось с применением разных тест-систем in vitro и in vivo.

|3-каротин и ликопин при концентрации 1 - 3мМ защищали клетки НТ29 (карцинома толстой кишки человека) от ДНК- разрывов, вызываемых генерацией супероксиданиона в системе ксантин/ксантин оксидаза. При исследовании этих веществ в более высокой концентрации защиты не наблюдалось [96]. Konopacka M. [1998] использовал метод ДНК-комет, чтобы проследить воссоединение разрывов ДНК, вызванных у-лучами. В-каротин (5 мг/мл) в комбинации с витаминами С (1 мг/мл) и Е (5 мг/мл) ускорил восстановление; за 90 мин. 80% разрывов были восстановлены в сравнении с 50% в контроле [90].

Также |3-каротин снижал степень повреждения ДНК, вызванное ультрафиолетом [52] или 8-метоксипсораленом и ультрафиолетом [91].

В экспериментах in vitro было показано, что бета-каротин и кантаксантин снижают количество микроядер, индуцированных блеомицином в культуре лимфоцитов человека [46]. В том же эксперименте была показана обратная зависимость между уровнем каротиноидов в плазме крови и количеством клеток с микроядрами, индуцированными блеомицином.

Модифицирующее влияние каротиноидов на мутагенное действие ксенобиотиков было показано также в экспериментах in vivo. Так, бета-каротин снижал число хромосомных аберрации, индуцированных бензо(а)пиреном и митомицином С в клетках костного мозга мышей [110, 111], а также число микроядер, возникающих при действии бензо(а)пирена

[137].

Renner et al. [1985] было показано дозозависимое влияние бета-каротина на уровень хромосомных аберраций в клетках костного мозга китайского хомячка, индуцированных мутагенами прямого действия -метилметансульфонатом, бусульфаном и тио - ТЭФ [113].

В экспериментах, проведенных Salvadori еt al. [1991, 1992], было исследовано влияние бета-каротина на цитогенетический эффект непрямого алкилирующего мутагена - циклофосфамида. Пятидневная предобработка бета-каротином приводила к снижению уровня хромосомных аберраций, индуцированньгх циклофосфамидом в клетках костного мозга мышей [119120].

Имеются данные о снижении под влиянием бета-каротина и других каротиноидов канцерогенеза, хромосомных аберраций, микроядер и аберрантных крипт толстой кишки в случае кормления мышей или крыс химическими канцерогенами или облучения[68, 102].

В некоторых исследованиях у у-облученных мышей наблюдалось значительное сокращение частоты микроядер в полихромных эритроцитах костного мозга и в эпителиальных клетках мочевого пузыря на фоне введения |3-каротина до или сразу после облучения [90]. Введение смеси (3-каротина, витаминов Е и С оказалось более эффективным [91].

S.J. Duthie et al. исследовали влияние добавочного потребления (3-каротина добровольцами в течение 10 недель. Было установлено, что лимфоциты крови добровольцев, принимающих единичные, большие дозы ( -каротина (25 мг) устойчивы к окислению ДНК, инициированному Н2О2

[66] .

В исследовании, проведенном P. Riso, 10 женщин добровольцев потребляли пищу, богатую томатным пюре (эквивалентную 16,5 мг ликопина в день) в одной группе, а в другой не употребляли вовсе томаты в пищу в течение 21 дня. Лимфоциты, исследуемые у первой группы добровольцев, оказались значительно более устойчивыми к нарушению окислительных процессов, вызванных Н2О2 in vitro [115].

K. Umegaki et al. изолировали лимфоциты после ежедневного потребления добровольцами 30 мг (3-каротина в течение 13 дней. Обработав клетки рентгеновским облучением, авторы обнаружили уменьшение числа микроядер по сравнению с контрольной группой. Более того, до и после приема препарата наблюдалась отрицательная корреляция между количеством микроядер и концентрацией в плазме ( -каротина [132].

Прием витаминов С (100 мг) и Е (280 мг), а также |3-каротина (25 мг) ежедневно в течение 20 недель группами курящих и некурящих (мужчин в возрасте 50 -59 лет) привел к значительному снижению степени эндогенного окисления пиримидина в лимфоцитах ДНК, что доказывает антиоксидантную защиту in vivo [66].

В другом исследовании эффективность отдельных каротиноидов -лутеина, ликопина и смеси а- и |3-каротина - исследовалась во время 12 -недельного эксперимента. Эффекта от дополнительного приема каротиноидов не было обнаружено при определении эндогенного повреждения ДНК в лимфоцитах, однако зафиксирована отрицательная корреляция между концентрацией каротиноидов в сыворотке крови и степенью окисления ДНК-оснований [55]. Корреляция была достаточно высокой, что позволяет предположить, что защита от повреждения ДНК осуществляется основным уровнем каротиноидов, полученных при сбалансированном питании, или же, что каротиноиды выступают просто в качестве маркеров других, действительно защитных веществ, которые встречаются в тех же продуктах питания, что и каротиноиды.

1.2.1.3. Эпидемиологические исследования биологической роли

каротиноидов

Многие эпидемиологические данные указывают на антиканцерогенное воздействие каротиноидов, и |3-каротина в особенности [107]. Выяснена связь между потреблением пищи, богатой каротиноидами, и относительно низкой заболеваемостью разными видами рака, включая рак легких, желудка, простаты, мочевого пузыря, пищевода и гортани [140]. Эти данные достоверны, так как подтверждены в нескольких широкомасштабных исследованиях. Например, заболеваемость раком пищевода и желудка в неблагополучных в этом отношении районах Китая заметно снизилась у добровольцев, принимавших витамин Е, |3-каротин и селен, по сравнению с другой группой, принимавших плацебо [47]. Имеется также еще целая группа эпидемиологических доказательств, свидетельствующих о благотворном влиянии каротиноидов на здоровье человека. Они обобщены в соответствующих обзорах [37, 107, 91, 68, 102, 139].

Вместе с этим, недавно появились два настораживающих сообщения. Во-первых, в Финляндии при эпидемиологическом восьмилетнем наблюдении за группой курильщиков (30 000 человек среднего возраста мужского пола), было показано, что дополнительное потребление |3-каротина или витамина Е может увеличить риск развития рака легких. Подобный результат был получен при исследовании в США, во время которого курильщикам и/или рабочим асбестовой промышленности назначали ретинол и |3-каротин [106]. Эксперимент прекратили преждевременно по этическим соображениям.

Другое исследование по уменьшению риска профессиональных заболеваний не обнаружило влияние |3-каротина на здоровье [83].

В настоящее время описанные данные широко дискутируются, однако уже сейчас ясна необходимость тщательного исследования механизмов мутаген- и канцерогенмодифицирующего действия бета-каротина с акцентом на выявление возможных комутагенных и коканцерогенных эффектов.

1.2.3. Аспартам - антимутагенный дипептид и его фармакологические

свойства

Аспартам - пищевой заменитель сахара, представляет собой метиловый эфир дипептида - аспартил-фенилаланина. Аспартам почти в 200 раз слаще сахара, низкокалориен, и в рамках рекомендованного суточного поступления (до 40 мг/кг) безвреден для человека. Рекомендуется для диетического питания, прежде всего больным диабетом и ожирением. Кроме того, аспартам весьма эффективен для модификации вкуса различных лекарственных форм. Также аспартам широко применяется в пищевой промышленности при производстве детского, диетического питания, напитков, десертов и других продуктов, не требующих термической обработки [35].

Сравнивая метаболизм аспартама у людей и животных Ranney et al. [1976] показал, что в обоих случаях аспартам полностью распадается на аспартат фенилаланин и метанол в течение нескольких часов. Пик концентрации в плазме наблюдался через 4 - 7 часов [112].

Moller [1991] исследовал метаболизм аспартама у человека. Шесть взрослых мужчин получали по 0,56 г фенилаланина (Phe) в форме 1,0 г аспартама или 12,2 г бычьего альбумина в 200 мл воды или только воду. Образцы венозной крови, собранные до эксперимента и во время последующих 4 часов, были исследованы на предмет уровня в плазме аминокислот (тирозин, триптофан, валин, изолейцин и лейцин), аспартата, инсулина и глюкозы. Кривая, показывающая концентрацию фенилаланина плазме была на 40% больше после приема аспартама по сравнению с альбумином, хотя это и не считается показательным. Указанные различия могут быть вызваны, значительным повышением инсулина под влиянием альбумина, на который аспартам не оказывает никакого действия. Наблюдалось влияние аспартама на содержание в плазме тирозина, но не триптофана, валина, изолейцина или лейцина [101].

Исследование антимутагенных свойств аспартама in vivo проводилось в лаборатории фармакогенетики НИИ Фармакологии РАМН. Были получены результаты, свидетельствующие о наличии у аспартама цитогенетической активности. Кулакова А.В. показала, что аспартам в диапазоне исследуемых доз 4-40 мг/кг обладает антимутагенными свойствами по отношению к диоксидину и циклофосфамиду. Выявленная антимутагенная активность аспартама более выражена при его пятидневном введении до использования мутагена, тогда как при совместном пятидневном введении аспартама с мутагенами подсластитель не влиял на кластогенное действие диоксидина и циклофосфамида [24].

Установленная антимутагенная активность аспартама была независимо подтверждена Creppy E.E., Baudrimont I., которые исследовали влияние аспартама на генотоксические эффекты охратоксина А [57]. Аспартам вводился животным отдельно или в сочетании с охратоксином А (ОТА). Анализ с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) показал, что от 10 до 12% аспартама распределяются в неизменном виде в крови, моче и в органах. После введения аспартама крысам в дозе 25 мг/кг уровень его составил 73+6 мкг/г, 1,8+0,1 мкг/г, 156+9 мкг/г, 34+2 мкг/г, 66+5 мкг/мл и 19+2 мкг/мл соответственно в почках, печени, мозге, яичке, моче и сыворотке крови. В присутствии ОТА в тех же органах и жидкостях уровень присутствия составил 68+5 мкг/г, 2,1+0,1 мкг/г, 105+9 мкг/г, 25+0,6 мкг/г, 45+3 мкг/мл и 11+0,2 мкг/мл. По мнению авторов это указывает на то, что аспартам связывает ОТА и тем самым препятствует его повреждающему действию [57].

Видимо, это действительно так, поскольку в дополнительных экспериментах было показано, что при совместном шестимесячном введении аспартама и микотоксина концентрация последнего в крови и почках существенно ниже, чем при введении только ОТА.

Эффективность аспартама в качестве протектора выше в тех случаях, когда он присутствует в плазме до ОТА и его количество уменьшается при возрастании концентраций токсинов, последнее также указывает в пользу описанного механизма антимутагенного действия аспартама.

Генопротекторные свойства аспартама были подтверждены также в экспериментах, направленных на исследование кариомегалии в клетках почечных тканей под действием ОТА[56]. После 6- недельного лечения комбинацией ОТА и аспартама, кариомегалия была предотвращена у 80% животных, а у 20% животных обнаружилось несколько больших ядер в сравнении с животными, которым давался только ОТА. Отсутствие повреждения ДНК показывает наличие защитого эффекта у аспартама, которым не обладает фенилаланин.

Аспартам в неизмененном виде (что составляет от 10 до 12 % от данной дозы), который имеет гораздо большую концентрацию, чем охратоксин А в организме в случае естественной контаминации,

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Препараты и оборудование

2.1.1. Препараты, мутагены и химические реактивы

Бета-каротин - пищевой каротиновый краситель Е160а (Hofmann la Roche, Швейцария) 30 % масляная суспензия (ЖБК) и 10 % водная суспензия ( ВБК ).

Аспартам (NutraSweet, Швейцария) гранулированный порошок. Представляет собой метиловый эфир L - а - аспартил -L- фенилаланина.

В качестве модельных мутагенов использовали циклофосфамид и диоксидин.

Циклофосфамид (N'- бис ((3- хлорэтил)-№-0-триметиленовый эфир диамида фосфорной кислоты) (Serva, Германия).

Диоксидин (1,4-Ди-^окись 2,3 бис-(ацетоксиметил)-хиноксалина) (Фармак он, Россия ).

Для приготовления цитогенетических препаратов применяли КС1, ледяную уксусную кислоту, этиловый спирт ректификованный высшей очистки, воду дистилированную; в процессе окрашивания метафазного материала - NaCl, красители азур-2 и эозин (все реактивы Реахим, Россия). Для изучения препаратов под микроскопом использовали иммерсионное кедровое масло (Россия) и орто-ксилол (Россия).

2.1.2. Оборудование.

Центрифуга ОПН - 3 (Россия)

Микроскоп Standart - 20, (Германия), 10 х 100

Весы лабораторные аналитические ВАД - 200М ГОСТ 24104 - 88, класс точности 2.

2.2. Животные.

В работе использовали мышей-самцов линии С57ВЬ/6 (питомник "Столбовая " РАМН) в возрасте 8 - 12 недель. Животных содержали при 12-ти часовом световом режиме, на стандартном брикетированном корме, при свободном доступе к воде в условиях вивария НИЛ фармакологической генетики НИИ фармакологии РАМН. В эксперименте было использовано 720 животных.

2.3. Метод учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей in vivo.

Метод позволяет учитывать хромосомные повреждения (ахроматические пробелы (гепы) и различные категории хромосомных аберраций) на стадии метафазы и рекомендован в качестве основного для проведения скрининга мутагенов и антимутагенов среди фармакологических соединений [6]. В отличие от методов in vitro, он позволяет учитывать не только эффект исследуемого соединения, но также его метаболитов, и биохимические события, приводящие к образованию эндогенных мутагенов, что обеспечивает надежную экстраполяцию экспериментальных данных на человека.

2.3.1. Схема обработки животных.

Эксперименты по изучению влияния комбинаций каротиноидов и аспартама на индуцированный мутагенез проводили в трех вариантах. Во всех случаях мутаген вводили внутрибрюшинно, комбинации исследуемых препаратов - перорально. Путь введения каротиноидов и аспартама соответствовал наиболее распространенному способу их поступления в организм человека. Кроме того, применение различных путей введения мутагенов и пищевых добавок позволяло исключить их возможное прямое взаимодействие.

2.3.1.1. Острый эксперимент.

Животные получали мутаген и одну из комбинаций каротиноидов (ЖБК, ВБК) и аспартама однократно; забой животных производили через 24 часа после введения соединений.

2.3.1.2. Предобработка.

Животным вводили одну из комбинаций каротиноидов (ЖБК, ВБК) и аспартама пятикратно с интервалом 24 часа, последнее введение сочеталось с однократной инъекцией мутагена; забой животных осуществляли через 24 часа.

2.3.1.3. Подострый эксперимент.

Комбинации каротиноидов (ЖБК, ВБК) и аспартама вводили совместно с мутагеном пятикратно, с интервалом между введениями 24 часа; забой животных производили через 6 часов после последнего введения.

2.3.2. Дозы.

Исследуемые комбинации вводили в двух вариантах. В первом аспартам применяли в дозе 0,4 мг/кг совместно с масляной суспензиией бета-каротина в дозах 0,5, 5 и 50 мг/кг или водной суспензиией из расчета 1,5, 15, 150 мг/кг, что в обоих случаях при перерасчете на чистый бета-каротин составило 0,15, 1,5 и 15 мг/кг. Во втором - аспартам вводили в дозе 4 мг/кг в сочетании с вышеуказанными препаратами бета-каротина.. С каждой дозой аспартама сочетали три вышеуказанные дозы каротиноидов.

Жирорастворимый ЖБК растворяли в рафинированном растительном масле, ВБК и аспартам - в дистиллированной воде непосредственно перед использованием.

Выбор доз каротиноидов и аспартама определялся исходя из опыта предыдущих исследований в НИИ фармакологии РАМН, направленных на изучение антимутагенных свойств указанных препаратов, который опирался на существующую практику клинического использования бета-каротина и аспартама, при котором потребление бета-каротина достигает 180 мг в сутки [8], аспартама 40 мг/кг [9].

Непрямой алкилирующий мутаген циклофосфамид вводили в дозе 20 мг/кг, прямой мутаген прооксидантного типа действия - диоксидин в дозе 300 мг/кг и 100 мг/кг. В указанных дозах эти мутагены наиболее часто используются в экспериментах по изучению модификации индуцированного мутагенеза. Выбор доз мутагенов был обусловлен установленным ранее заключением, что при исследовании на антимутагенность тем выше получение статистически достоверных результатов, чем выше повреждающая активность используемого мутагена [20]. Те же дозы мутагенов применялись в более ранних исследованиях, направленных на изучение антимутагенных свойств аспартама и бета-каротина [3, 25].

Во всех вариантах эксперимента мутагены растворяли в физиологическом растворе непосредственно перед обработкой животных.

Внутрибрюшинные и пероральные введения осуществляли в объемах, не превышающих 0,25 мл/мышь, с помощью одноразовых микрошприцов. 2.3.3. Приготовление цитогенетических препаратов.

Цитогенетические препараты готовили стандартным суховоздушным способом по Preston et al [1987]. За 2,5 часа до забоя животным вводили 0,025% раствор колхицина из расчета 0,01 мл/г с целью подавления формирования ахроматинового веретена клеточного деления и накопления метафаз [109].

Забой животных осуществляли смещением шейных позвонков. Затем максимально быстро выделяли бедренные кости, срезали эпифизы и вымывали клетки костного мозга гипотоническим раствором (0,55 % KCl), предварительно подогретым до 37⁰С. После инкубации при 37⁰С в течение 15 минут клеточную взвесь центрифугировали 5 минут при 1000 об/мин (центрифуга ОПН - 3, Россия). Супернатант сливали, осадок ресуспензировали и добавляли 3 мл предварительно охлажденного фиксатора, состоящего из смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3 : 1. Время инкубации клеток в фиксаторе составляло 10 минут. Затем проводили повторное центрифугирование и смену фиксатора (3 мл). После этого клетки инкубировали в холодильнике еще 20 минут. Взвесь вновь центрифугировали, удаляли супернатант, осадок ресуспензировали в 0,5 мл вновь добавленного фиксатора и наносили на предварительно обезжиренные и охлажденные стекла, которые высушивали в пламени спиртовой горелки.

Окраску производили азур - эозином. Состав красителя включал: 5 частей азура (0,1 %), 2 части эозина (0,1 %), 10 частей дистилированной воды с небольшим добавлением 5 % раствора Ка₂С0₃х10 Н₂О. При цитогенетическом анализе использовали микроскоп Standart - 20, ФРГ,

10х100.

Цитогенетический анализ проводили стандартно на основе рекомендаций Scott et al. [122], при этом учитывали клетки с ахроматическими пробелами (гепами), одиночными и парными фрагментами хромосом, хромосомными обменами и клетки с множественными повреждениями хромосом (более 5 хромосомных повреждений в клетке). На каждое животное анализировали по 100 метафаз, в каждой группе было исследовано 4 -6 животных.

2.4. Статистическая обработка.

Статистическую обработку ( ф- критерий ) проводили путем сравнения долей аномальных клеток в контрольной и экспериментальных группах [26]. Расчет антимутагенного эффекта производили по формуле:

М1 - М2 М1

где: АЭ - антимутагенный эффект (%), М1 - % метафаз с аберрациями при действии мутагена, М2 - % метафаз с аберрациями при действии мутагена и исследуемой комбинации.

З.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Исследование влияния комбинаций аспартама и бета-каротина на кластогенные эффекты мутагенов в остром эксперименте.

В данной серии экспериментов мутагены и исследуемые комбинации аспартама и каротиноидов вводили совместно однократно, ЖБК и ВБК в дозах - 0,15, 1,5 и 15 мг/кг с аспартамом в дозе 4 или 0,4 мг/кг. В качестве позитивного контроля использовались данные, полученные в экспериментах на животных, которым инъекцировался только мутаген.

3.1.1. Комбинации аспартама и бета- каротина в жирорастворимой

форме.

Результаты влияния комбинаций препаратов ЖБК и аспартама на кластогенные эффекты циклофосфамида представлены в таблице 3.

Исследование уровня хромосомных аберраций, индуцированных при однократном воздействии циклофосфамида в дозе 20 мг/кг выявило 17,8±1,7 % поврежденных метафаз, при этом на каждые 100 клеток было зарегистрировано 4,2 клеток с гепами, 11,0 с одиночными фрагментами, 1,8 с парными фрагментами, 0,2 с обменами, 0,6 метафаз с множественными повреждениями хромосом.

Использование комбинации из ЖБК в дозе 0,15 мг/кг с аспартамом в дозе 0,4 мг/кг привело к статистически значимому снижению кластогенного действия циклофосфамида на 28%. Количество поврежденных клеток было равно 12,8±1,5 %. Спектр хромосомных повреждений на каждые 100 клеток 1,8 гепов, 9,2 одиночных фрагментов, 1,6 парных фрагментов, метафазы с множественными повреждениями выявлены не были.

Использование диоксидина на фоне пятидневного введения комбинации с ВБК в дозе 1,5 мг/кг привело к статистически значимому снижению количества клеток, повреждаемых мутагеном до 9,8±1,4 % (Р < 0,05). В спектре хромосомных повреждений было обнаружено 8,2 клеток с одиночными и 0,6 парными фрагментами, 0,2 клеток с обменами и 3,2 клеток с множественными повреждениями.

У животных, предобработанных комбинацией с ВБК в дозе 15 мг/кг, диоксидин вызвал повреждение у 8,0±1,3 % исследованных клеток, что, при сравнении с данными позитивного контроля, свидетельствует о снижении цитогенетического действия мутагена. Качественный состав поврежденных метафаз : 1,4 гепов, 5,0 одиночных 1,0 парных фрагментов, 0,8 обмена, 2,8 метафаз с множественными повреждениями на каждые 100 клеток.

Таблица 14 также содержит результаты аналогичных экспериментов, направленных на изучение комбинаций с водорастворимым бета-каротином и аспартамом в дозе 4 мг/кг.

Диоксидин при однократном воздействии индуцировал хромосомные повреждения у 18,0+1,7 % исследованных клеток. Спектр хромосомных повреждений был представлен : гепами 0,75, одиночными фрагментами 10,75, парными фрагментами 0,75, обменами 1,75, метафазами с множественными повреждениями хромосом 10,0 на каждые 100 клеток.

Использование для предобработки животных комбинации ВБК в дозе 0,15 мг/кг и аспартама в дозе 4 мг/кг не привело к статистически значимому снижению уровня индуцированных диоксидином аберрантных клеток. Анализируемые показатели по качественному и количественному составу не отличались от контрольных, уровень повреждений составил 15,0+1,6 %. На каждые 100 клеток приходилось : 0,2 гепа, 10,6 одиночных и 1,2 парных фрагментов, 1,8 обменов, 7,2 метафаз с множественными повреждениями.

Использование для предобработки комбинаций с ВБК в более высоких дозах 1,5 и 15 мг/кг, позволило зарегистрировать статистически значимое снижение уровня индуцируемых диоксидином клеток. В результате анализа

400 метафаз, полученных после однократной инъекции диоксидина в дозе 300 мг/кг было обнаружено (соответственно дозам ВБК) 3,0 и 2,8 гепов, 8,75 и 8,0 одиночных фрагментов, 0,75 и 1,0 парных фрагментов, 3,0 и 2,4 метафаз с множественными повреждениями хромосом. Общее количество поврежденных метафаз составило 11,0+1,6 % и 8,4+1,2 %.

Таким образом, при предварительном пятидневном введении комбинаций из водорастворимого бета-каротина в дозах 1,5-15 мг/кг с аспартамом как в дозе 0,4 мг/кг, так и в дозе 4 мг/кг значимо снижают мутагенный эффект диоксидина в дозе 300 мг/кг. Комбинации аспартама с ВБК в минимальной дозе 0,15 мг/кг не эффективны по отношению к эффектам мутагенов.

Совокупность данных, полученных при изучении цитогенетических эффектов циклофосфамида и диоксидина, у животных, предварительно получавших комбинации из каротиноидов и аспартама в течение 5 дней, позволяет отметить следующие экспериментальные факты.

1. Предобработка животных комбинациями препаратов из жирорастворимого бета-каротина в дозе 15 мг/кг (но не в дозах 0,151,5 мг/кг) с аспартамом в дозах 0,4 мг/кг и 4 мг/кг приводит к ослаблению эффектов циклофосфамида.

2. Комбинации препаратов из жирорастворимого бета-каротина в дозах 0,15-15 мг/кг с аспартамом в доззе 0,4 мг/кг после предварительного пятидневного введения уменьшают кластогенный эффект диоксидина в дозе 100 мг/кг. Также действуют комбинации из ЖБК в дозах 1,5-15 мг/кг с аспартамом в дозе 4 мг/кг. При использовании в данной комбинации ЖБК в минимальной дозе 0,15 мг/кг препарат не активен.

3. Предобработка животных комбинациями из препаратов жирорастворимого бета-каротина в дозах 1,5-15 мг/кг с аспартамом как в дозе 0,4 мг/кг, так и 4 мг/кг значимо влияет на уровень клеток с хромосомными повреждениями, при использовании в качестве мутагена диоксидина в дозе 300 мг/кг. Но при использовании в комбинациях ЖБК в дозе 0,15 мг/кг они не снижают цитогенетический эффект этого мутагена.

4. Комбинации препаратов водорастворимого бета-каротина в дозах 0,15-15 мг/кг с аспартамом в дозе 0,4 мг/кг после предварительного пятидневного введения уменьшают кластогенный эффект циклофосфана. Также эффективны комбинации из препаратов ВБК с аспартамом в дозе 4 мг/кг.

5. Предобработка животных комбинациями с ВБК в дозе 15 мг/кг и аспартамом в дозе 0,4 мг/кг и 4 мг/кг приводит к ослаблению эффекта диоксидина в дозе 100 мг/кг, но не эффективна при использовании в комбинациях ВБК в меньших (0,15-15 мг/кг) дозах.

6. Комбинация препарата водорастворимого бета-каротина в дозе 0,15 мг/кг в сочетании с аспартамом в дозах 0,4 и 4 мг/кг не оказывает значимого влияния на кластогенные эффекты диоксидина в дозе 300 мг/кг. Увеличение дозы ВБК в комбинациях с аспартамом до 1,5-15 мг/кг делает их активными по отношению к используемому мутагену, снижая его цитогенетический эффект.

3.3. Исследование влияния комбинаций из аспартама и бета-каротина на кластогенные эффекты мутагенов при совместном

многодневном введении.

В этой серии экспериментов комбинации каротиноидов и аспартама вводили совместно с мутагенами в течение 5 дней. Забой животных осуществляли через 6 часов после последнего введения. В качестве позитивного контроля использовалась группа животных, которой вводился только мутаген в течение 5 дней в той же, что и в опыте дозе.

3.3.1. Комбинации аспартама с жирорастворимым бета-каротином

Результаты, полученные при цитогенетическом обследовании животных, получавших циклофосфамид раздельно или совместно с комбинацией ЖБК и аспартама в течение 5 дней, представлены в таблице 15.

В контрольной группе, где животные обрабатывались только циклофосфамидом, мутаген в условиях пятидневного введения индуцировал хромосомные аномалии у 19,2±1,8 % клеток костного мозга мышей. При этом было зарегистрировано 0,2 гепа, 15,8 одиночных фрагментов, 0,8 парных фрагментов, 1,4 обменов и 4,2 клеток с множественными повреждениями на каждые 100 исследованных метафаз.

После совместного введения циклофосфамида с комбинацией из ЖБК в дозе 0,15 мг/кг в сочетании с аспартамом в дозе 0,4 мг/кг в течении 5-ти дней уровень аберрантных клеток снизился до 16,2±1,6 %, однако, достоверных различий с данными позитивного контроля установлено не было. Спектр хромосомных повреждений на каждые 100 исследованных клеток был следующий: 0,2 гепа, 14,6 одиночных фрагментов, 0,6 парных фрагмента, 1,2 обменов, 2,0 метафаз с множественными повреждениями.

В следующей серии эксперимента циклофосфамид вводили совместно с комбинацией ЖБК в дозе 1,5 мг/кг и аспартамом в дозе 0,4 мг/кг. Анализ 500 метафазных пластинок позволил выявить повреждения у 13,6±1,5 % клеток. При этом в спектре хромосомных повреждений преобладали одиночные фрагменты - 12,8 на каждые 100 исследованных метафаз, кроме этого было зарегистрировано 0,2 гепа, 0,6 парных фрагмента и 1,8 метафазы с множественными повреждениями. При статистической обработке были выявлены достоверные различия между установленными экспериментальными данными и значениями позитивного контроля с уровнем значимости Р<0,05, свидетельствующем о снижении эффекта мутагена.

Опираясь на последний результат и рассматривая в совокупности данные вышеописанных экспериментов можно прийти к заключению, что антимутагенного потенциала аспартама при его однократном применении в дозе 0,4 мг/кг недостаточно для модификации эффекта мутагена, тогда как введение в систему бета-каротина создает необходимые предпосылки для манифестации его антимутагенной активности в наименьшей из использованных доз. Важно, что данное наблюдение по существу является первым свидетельством, указывающим на возможность усиления антимутагенного эффекта одного соединения за счет его комбинирования с другим, не активным в избранных условиях эксперимента, веществом.

В следующей серии острого эксперимента в качестве мутагена был использован диоксидин в дозе 100 мг/кг. Эффект мутагена был снижен на 46 и 40 % под действием комбинации из аспартама (0,4 мг/кг) и, соответственно, жиро- и водорастворимого бета-каротина в дозе 15 мг. Обращает внимание, что в тех же условиях эксперимента отдельно взятый в той же дозе аспартам снижал цитогенетический эффект мутагена на 45 %.

Сходные по структуре данные были получены при использовании аспартама в дозе 4 мг/кг. Отдельно взятое соединение редуцировало эффект мутагена на 66 %, тогда как комбинации аспартама с жирорастворимым бета-каротином проявляли антимутагенную активность только при использовании последнего в дозах 1,5 и 15 мг/кг, соответственно, 54 и 57 % редукции мутагенного эффекта. В комбинации с водорастворимым бета-коротином только при его использовании дозе 15 мг/кг - 43 % снижение эффекта.

Обобщающий анализ экспериментов с диоксидином обращает внимание, что при сочетанном использовании аспартама и бета-каротина антимутагенный эффект приобретает избирательный характер и не проявляется у большей части исследованных комбинаций. Создается впечатление, что одновременное применение бета-каротина с аспартамом с пороговой дозовой зависимостью препятствует проявлению антимутагенности последнего. В то же время комбинация не приобретает комутагенной активности, что практически важно, и при оптимальном подборе доз проявляет искомые антимутагенные свойства. Последнее в полной мере подтверждается анализом данных, полученных при испытании исследованных комбинаций в острых экспериментах, предусматривающих применение диоксидина в дозе 300 мг/кг, в которых их антимутагенные свойства были полностью подтверждены.

Важно отметить, что с момента начала систематических исследований по антимутагенезу подавляющее большинство экспериментов было сделано в условиях однократного введения сочетаний мутагена и предполагаемого модификатора. Однако, последние 5-7 лет усилиями отдела фармакологической генетики (руководитель академик РАМН С.Б. Середенин) и входящей в его состав лаборатории фармакологии мутагенеза НИИ фармакологии РАМН было показано, что проявление эффектов отдельно взятых антимутагенов может существенно зависеть от режима их применения относительно мутагена [3, 10, 25]. Каких-либо сведений об изучении в этом аспекте антимутагенных комбинаций в предшествующих опубликованных работах не содержится, не смотря на то, что этот вопрос имеет очевидный теоретический и практический интерес. Данные, восполняющие этот пробел были получены в настоящей работе и проанализированы ниже, на примере экспериментов предусматривающих предварительное повторное введение антимутагенных комбинаций перед введением мутагенов (предобработка) и повторное совместное введение антимутагенных комбинаций с использованными мутагенами (совместное введение).

В условиях предобработки было установлено, что комбинации аспартама в дозе 0,4 мг/кг и жирорастворимого бета-каротина, применяемого из расчета 1,5 и 15 мг/кг редуцировали эффект циклофосфамида на 35 и 43%, соответственно. При использовании в составе комбинации водорастворимого бета-каротина антимутагенный эффект был еще более выражен и наблюдался во всех вариантах эксперимента на уровне 34 - 50 % уменьшения цитогенетического эффекта мутагена. Также как в серии с однократным введением, в условиях предобработки наблюдаемый защитный эффект отчетливо зависел от дозы бета каротина и возрастал с ее увеличением.

На фоне пятидневной предобработки животных аспартамом в дозе 4 мг/кг и жирорастворимого бета-каротина снижение цитогенетического эффекта циклофосфамида было обнаружено только при использовании провитамина в максимальной из использованных доз 15 мг/кг. При использовании в составе комбинации водорастворимого бета-каротина были выявлены более выраженные эффекты. В этом случае, все варианты комбинации сходным образом на 46-49 % уменьшали проявление цитогенетического эффекта мутагена. При более детальном анализе становится очевидным, что оптимум дозировок исследованных форм бета-каротина в составе использованных комбинаций не зависит от дозы аспартама и лежит в области 1,5 - 15 мг/кг. Существенно, что комбинации аспартама с бета-каротином в дозе 0,15 мг/кг не влияют на цитогенетический эффект мутагена.

В аналогичных по способу выполнения экспериментах с диоксидином в дозе 100 мг/кг было установлено, что эффект мутагена на фоне предобработки животных комбинациями астартама (0,4 мг/кг) и жирорастворимого бета-каротина уменьшается на 44, 43 и 60 %, соответственно, при использовании провитамина из расчета 0,15, 1,5 и 15 мг/кг. Тогда как при использовании водорастворимой формы бета-каротина антимутагенный эффект наблюдается только при его применении в дозе 15 мг/кг.

В экспериментах по изучению влияния предобработки комбинациями, в которых доза аспартама была увеличена до 4 мг/кг, эффекты снижения цитогенетического действия мутагена были отмечены только при использовании жирорастворимой формы бета-каротина в дозах 1,5 и 15 мг/кг и водорастворимой - в дозе 15 мг/кг.

При испытании влияния предобработки комбинациями на цитогенетическую активность диоксидина используемого в дозе 300 мг/кг был получен пул достаточно однородных данных, свидетельствующий о том, что антимутагенным эффектом (от 25 до 55 % уменьшения цитогенетического эффекта) обладают все использованные комбинации, за исключением тех, в которых бета-каротин представлен в наименьшей из исследованных доз - 0,15 мг/кг (табл.21).

Таким образом, в экспериментах с диоксидином, также как в экспериментах с циклофосфамидом, выявлена существенная специфичность проявления антимутагенных эффектов изучаемых комбинаций в зависимости от доз составляющих компонентов. При этом, во всех вариантах эксперимента было отмечено, что бета-каротин в обеих формах в дозе 15 мг/кг в сочетании с аспартамом в обеих дозах практически с одинаковой эффективности редуцирует цитогенетические эффекты использованных мутагенов. Также обращает внимание, что при данном способе обработки антимутагенный эффект комбинаций ни в одном случае не превышает эффекта ее отдельно взятых компонентов, что однозначно указывает на отсутствие аддитивности в действии избранных антимутагенов.

С точки зрения теории и практики антимутагенных исследований принципиальную важность имеет вопрос о влиянии экзогенных антимутагенов на проявление генотоксических эффектов мутагенов в условиях повторного совместного введения. Результаты, полученные в экспериментах с циклофосфамидом, демонстрируют, что комбинации, включающие бета-каротин в жиро- и водорастворимых формах в дозах 1,5 и 15 мг/кг и аспартам в дозах 0,4 и 4 мг/кг, способны редуцировать эффект мутагена на 30 - 54 %. При этом антимутагенное действие несколько в большей степени выражено в случаях использования аспартама в дозе 4 мг/кг.

Комбинации аспартама в дозе 0,4 мг/кг с жирорастворимой формой бета-каротина, применяемой из расчета 1,5 и 15 мг/кг, редуцировали мутагенный диоксидина (100 мг/кг) на 42 и 54 %, соответственно. Комбинации аспартама с водорастворимой формой провитамина оказались эффективны только при использовании последнего в дозе 15 мг/кг (51 % редукция эффекта). В случае применения аспартама в дозе 4 мг/кг в комбинации с провитамином обе формы бета-каротина проявили антимутагенное действие только при использовании в дозе 15 мг/кг. Эффективность комбинации с водорастворимой формой бета-каротина была выражено в большей степени - 46 % редукции мутагенного эффекта против 24 % в случае применения жирорастворимой формы.

В экспериментах, предусматривающих использование диоксидина в дозе 300 мг/кг, антимутагенные свойства продемонстрировали только те комбинации аспартама (0,4 мг/кг) с бета-каротином в жирорастворимой и водорастворимой формах, в которых провитамин был использован из расчета 15 мг/кг. Повышение дозы аспартама до 4 мг/кг позволило выявить антимутагенные эффекты его комбинаций с жирорастворимым бета-каротином во всех вариантах дозировок последнего, тогда как водорастворимая форма оказалась эффективной только в дозах 1,5 и 15 мг/кг. Ни в одном из упомянутых вариантов редукция эффекта мутагена не превышала 32 % при отсутствии дозовых зависимостей антимутагенных эффектов.

Анализ совокупности материалов изложенных выше позволяет указать сделать несколько обобщающих заключений.

Во-первых, антимутагенный эффект исследованных комбинаций независимо от режима обработки животных и использованных мутагенов проявляется при сочетанном использовании аспартама в дозах 0,4 и 4 мг/кг и бета-каротина в жиро- и водорастворимой формах в дозе 15 мг/кг.

Во-вторых, комбинации аспартама в дозах 0,4 и 4 мг/кг с бета-каротином в водо- и жирорастворимых формах во всем диапазоне использованных доз снижают мутагенное действие циклофосфамида в остром эксперименте. Тогда как в условиях предобработки аналогичным эффектом обладают только комбинации с водорастворимой формой бета-каротина.

В-третьих, ни в одном варианте эксперимента не выявлено превосходство какой-либо комбинации над любым из составляющих ее компонентов в эффективности антимутагенного действия. Следовательно, в антимутагенности исследованных соединений отсутствует аддитивность эффектов. Однако, при сравнении по таким показателям как зависимость антимутагенного эффекта от режима обработки животных или использованного мутагена становится очевидным, что спектр антимутагенной активности комбинаций более широк, чем у ее отдельных компонентов. Комбинации эффективны даже в тех случаях, когда их компоненты не эффективны по отдельности (графа 1, 2, табл. 21). Более того, при анализе данных с приоритетным учетом режима обработки животных становится очевидным, что аспартам и бета-каротин выгодно дополняют действие друг друга. Особенно показательно эта тенденция проявляется в случае использования комбинаций, включающих аспартам в дозе 4 мг/кг (см. табл.).

Таблица 22. Сравнительная эффективность антимутагенного действия комбинаций «аспартам+бета-каротин» и ее компонентов.

Соединения	Однократно	Предобработка	Совместно
Аспартам		+
ЖБК	-		+
ВБК			+
Комбинации	+	+	+

+ -статистически достоверная редукция эффектов мутагена при применении антимутагенов во всех используемых дозах

+/- -антимутагенный эффект проявился только при использовании соединений в одной максимальной дозе и/или только по отношению к одному мутагену

- - отсутствие антимутагенного эффекта

В-четвертых, ни в одном варианте эксперимента не выявлено проявления комутагенных эффектов или антагонизма в действии соединений в исследованных комбинациях. Это, в сочетании со сведениями, изложенными выше, указывает на перспективность совместного использования аспартама и бета-каротина.

Одним из центральных вопросов, касающихся теоретического осмысления перспективы практического использования антимутагенов является вопрос о специфичности и универсальности их действия.

Рассматривая полученные данные с этой позиции, следует выделить два момента (1) отсутствие специфичности в качественном отношении -антимутагенная модификация достаточно, на среднем уровне 40-60 %, выражена в отношении эффектов обоих мутагенов и (2) очевидную зависимость антимутагенных эффектов комбинаций от доз, в которых используются ее компоненты, т.е. по существу отсутствие специфичности по отношению к разным мутагенам и совершенно отчетливую зависимость (специфичность) действия по отношению к этим мутагенам, в зависимости от доз использованных компонентов и в меньшей степени от режима их использования. При этом практически важным является выявление тех доз компонентов комбинаций, в которых их сочетанное применение нивелируют зависимость проявления антимутагенных эффектов от режима обработки. А именно - аспартам в дозе 0,4 и 4 мг/кг и бета-каротин в дозе 15 мг/кг.

Рассматривая предложенные дозировки как оптимальные, обеспечивающие наибольшую универсальность в проявлении защитных эффектов, важно сравнить в какой форме предпочтительнее использовать бета-каротин.

Анализ данных, представленных в табл. 21, с этой точки зрения показывает, что не имеется принципиальной разницы между антимутагенными эффектами комбинаций, содержащих ту или иную форму бета-каротина при их использовании в максимальной дозе. Однако, некоторое преимущество жирорастворимой формы выявляется при анализе данных, полученных в экспериментах с диоксидином с различными способами обработки животных. Интересно, что при сравнении данных, полученных в экспериментах с использованием циклофосфамида, такой закономерности не наблюдается, комбинации с обеими формами бета-каротина практически не различаются по антимутагенному эффекту. Представляется, что это может трактоваться как одно из проявлений специфичности антимутагенного действия исследованных комбинаций.

Одной из заявленных целей обсуждения явилось сравнение антимутагенной эффективности исследованных комбинаций и других антимутагенов. Наибольший интерес в этом плане вызывает сопоставление эффектов комбинаций с эффектами их составляющих уже описанное выше. Сравнение антимутагенных эффектов исследованных комбинаций с данными других исследований достаточно затруднено, поскольку представленная работа является первой, в которой экспериментально исследуются эффекты сочетанного применения двух антимутагенов. Тем не менее, очевидно, что, в целом, антимутагенный эффект исследованных комбинаций не превышает 50 %, что вполне сопоставимо с эффектами большинства известных природных антимутагенов или антимутагенов синтетических, но аналогичных природным по химическому строению, исчерпывающую информацию о которых можно найти в монографиях и статьях обзорного характера [30, 31]. Уровень в 50 % защиты был ранее признан как минимально достаточный для признания антимутагена перспективным к дальнейшей разработке [6]. В нашем случае на эту роль вполне могут претендовать комбинации, обеспечивающие поступление в организм бета-каротина из расчета 15 мг/кг и, в меньшей степени 1,5 мг/кг, а также аспартама в дозе 0,4 и 4 мг/кг.

Отдельно следует отметить, что по степени проявления антимутагенных эффектов исследованные комбинации, а также, как было отмечено ранее Л.С. Большаковой [1998] и А.В. Кулаковой [1998], их компоненты не уступают фармакологическим индукторам интерферона, бензодиазепиновым транквилизаторам, но очевидно проигрывают синтетическим антимутагенам производным 2-меркаптобензимидазола (бемитил, афобазол), с помощью которых возможно полное устранение повреждающего действия отдельных мутагенов [17, 19]. Однако не следует забывать, что эти соединения направленно разрабатывались в качестве специфических фармакологических средств защиты генома, тогда как комбинации соединений, исследованных в настоящей работе, следует рассматривать как не специфически повышающие устойчивость к мутагенным воздействиям. Их очевидным преимуществом является то, что для их использования в качестве антимутагенов не требуется специальных разрешений директивных органов. Более того, по существу они уже сегодня широко используются в качестве дополнительных компонентов в составе пищевых продуктов, в том числе продуктов лечебно-профилактического назначения [28], а также имеют очевидные перспективы использования в качестве дополнительных компонентов в составе ряда современных лекарственных форм; сиропы, эмульсии и пр.. Определенный вклад в подбор оптимального качественного и количественного состава дополнительных компонентов (красителей и подсластителей) в составе таких форм призваны сыграть вышеописанные результаты. В этой связи следует указать, что на сегодняшнем фармацевтическом рынке имеется достаточно большое количество лекарственных препаратов, в которых наряду с бета-каротиновыми красителями в качестве подсластителя используется сахарин. Генотоксическая безопасность применения последнего находится под сомнением, имеется достаточно большое количество исследований, в которых были обнаружены его ДНК-повреждающие и мутагенные свойства [15, 16, 43]. Вероятно, назрела необходимость замены этого явно неудачного сочетания на комбинации бета-каротина с аспартамом, которые безопасны с генетической точки зрения. Более того, в составе одной лекарственной формы с потенциально генетическим агентом, примером которого может служить парацетамол, широко применяемый именно в составе эмульсий, выявленные нами антимутагенные комбинации могут заметно снизить риск проявления его повреждающего действия. Примеры, подобного использования антимутагенов имеются в современной литературе. В частности, на основе мутагенного нитрофурадонина была создана его безопасная лекарственная форма, включавшая помимо активного вещества антимутаген глицирам [17].

Открытым остается вопрос о том, каким образом исследованные комбинации будут воздействовать на эффекты других мутагенов. Учитывая, что наблюдается определенный параллелизм в модификации эффектов мутагенов, обладающих сходными механизмами мутагенного действия [17] можно ожидать, что они будут способны уменьшать мутагенные эффекты не только циклофосфамида, но и других промутагенов алкилирующего типа

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алекперов У.К. // Антимутагенез. Теоретические и прикладные аспекты./ М.: Наука, 1984 г., 100 стр.

2. Бобков Ю.Г.//Изучение фармакокинетики биметила/ Фармак. и токсикол.-№5.-1984.-54-56.

3. Большакова Л.С.// Сравнительное исследование влияния каротиноидов на цитогенетические эффекты циклофосфамида и диоксидина у мышей/ Автореф. диссер. кандид. биол. наук. Москава, 1998.

4. Бочков Н.П. Современная клиническая генетика издоровье человека. Доклад. 2001.

5. Бочков Н.П. и др.//Монитортнг врожденных пороков развития/ Росс. Вест. перинатол.- 1996.-№2.-20-26.

6. Бочков Н.П., Катосова Л.Д.//Генетический мониторинг популяций человека при реальных химических и радиационных нагрузках./Вестн.РАМН.-1992.-№ 4.-10-14.

7. Бочков Н.П.,Дурнев А.Д.,Журков В.С. и др.// Система поиска и изучения соединений с антимутагенными свойствами. (Методические рекомендации)/ Хим.-фарм.жур, -1992,- N.9 - 10, .42 - 46.

8. Букин Б.В. // Эпидемиологические вопросы витаминопрофилактики рака / Вопросы онкологии, 1990, т. 36, № 6, стр. 643-652

9. Булдаков А.С.// Пищевые добавки. Справочник./С.-Петербург, "Ut".-1996.-240 с.

10. Георгиев В.Н. // Фармакологическое изучение антимутагенных свойств убихинона-10. / Вестн. Рос. АМН. - 1997. - №7. - С.3-8.

11. Гончарова Р.И.//Антимутагенез как генетический процесс./ Вестник РАМН.-1993.- № 1.-26-33.

12. Даугель-Дауге Н.О., А.Д. Дурнев, А.В. Кулакова и др.// Корпускулярный мутагенез и его профилактика./Вест. Рос. АМН, 1995, N 1, стр. 29 - 37.

13. Дубинин Н.П. // Новое в современной генетике. /М., "Наука". - 1986. -

206с.

14. Дурнев А.Д. //Мутагены и антимутагены в продуктах питания./ Генетика.-1997.-Т.33.-2.-165-176

15. Дурнев А. Д. и соавт.//Мутагенмодифицирующие эффекты бета-каротина in у1уо./Генетика.-1997.-№5.-717-721.

16. Дурнев А.Д., Орещенко А.В., Саришвили Н.Г. // Продукты питания и индуцированный мутагенез. Обзор./ Хран. и перераб. с/х сырья.-1995.-№5.-21-23.

17. Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Мутагены.- М.: Медицина, 1998.-328.

18. Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Фармакологическая защита генома. - М.: ВИНИТИ, 1992. - 159 с.

19. Жанатаев А.К.// Экспериментально-фармакологическое изучение антимутагенной активности афобазола/ Автореф. диссер. кандид. биол. наук. Москава, 2001.

20. Журков В.С., Сычева Л.П.// Роль системы микросомальных монооксигеназ в модификации эффектов мутагенов/ Вестник РАМП, 1993, № 1, стр. 41-46

21. Засухина Г.Д.// Проблемы практического использования антимутагенов. / В сб.: "Мутагены и канцерогены окружающей среды и наследственность человека", часть 2, Москва. - 1994. - 192-214.

22. Захидов С.Т., Баршак Т.Л., Смирнова О.Б. и др.// Модифицирующие цитогенетические эффекты госсипола и его производных./ Изв. Акад. Наук, серия Биология.-1994.-№ 4.-694-700.

23. Капитанов А.Б., Пименов А.М. // Каротиноиды как антиоксидативные модуляторы клеточного метаболизма. /Успехи современной биологии. - 1996.-№ 2. - 179-193.

24. Кулакова А.В. и соавт.//Антимутагенная активность аспартама./ Экспер. и клинич. Фармакология.-1999. Т62.-№4.-48-50.

25. Кулакова А.В.// Фармакологическое исследование модифицирующих эффектов циклофосфамида и диоксидина/ Автореф. диссер. кандид. биол. наук. Москава, 1998.

26. Лакин Г.Ф. Биометрия : Учеб. пособие для биол. спец. вузов - 4-е изд., перераб. и доп. - М.: Высш. шк., 1990. - 352с.

27. Новиков А.В. Экология, окружающая среда и человек.-М: Наука.- 2001.-

306с.

28. Орещенко А.В. Пищевая комбинаторика и генетическое здоровье человека. М.: ПИЩЕПРОМИЗДАТ, 1999, 206с.

29. Орещенко А.В., Тюрина Л.С., Гусева Н.В., Дурнев А.Д. //Влияние апо-каротина на спонтанный и индуцированный мутагенез у мышей./Тезисы докладов росс.конф. "Мутагены и канцерогены окружающей среды."-Казань.-1996.-34.

30. Порошенко Г.Г., Абилев С.К.// Антропогенные мутагены и природные антимутагены./Итоги науки и техники. Сер. общ.генет., ВИНИТИ.-1988.-

т. 12.-1-206.

31. Порошенко Г.Г.//Антимутагены: подходы к классификации и перспективы поиска активных соединений./Вестник РАМН.-1995.- № 1.38-44.

32. Худолей В.В.//Модификации мутагенеза и антиканцерогенез / Вестник РАМН, 1993, № 1, 34-41

33. Черепнев и соавт.// Общие вопросы антимутагенной защиты организма/

Вестник РАМН.- 1999.-№1.

34. Якушина Л.М., Малахова Э.Н., Шкарина Т.Н. и др. . Вопр. мед. химии.-1995.- 41(4).- 36-41.

35. Регистр Лекарственных средств России.- 1998.-1234с.

36. Abraxam S.K., S.Mahajan ,Kesavan P.C. // Inhibitory effects of dietary vegetables on the in vivo clastogenicity of cyclofosphamide. / Mutat. Res. -1986.-172.-51-54.

37. Alpha-tocoopherol, Beta-carotene Cancer Prevention Study Groop, The effect of Vitamin E and Beta-carotene on the insidence of lung cancer/ N. Engl. J.

Med.-330.-1994.-1029-1035.

38. Ambrosone C.B., Freudenheim J.L.//Manganese superoxide dismutase genetic polymorphisms, dietary antioxidantse and risk of breast cancer.// Cancer Res.-59(3).-1999.-602-606.

39. Ames B.N.// Cancer prevention and diet: help from single nucleotide polymorphisms/ PNAS 96.-1999.- 12216-12218.

40. Ames B.N.// Micronutrient deficiencies: a major cause of DNA damage, in: H.L. Bradlow, J. Fishman, M.P. Osborne (Eds.)// Cancer Prevention: Novel Nutrient and Pharmaceutical Developments, Annals of The New York Academy of Sciences.- New York.- 2000.- 87-106.

41. Ames B.N.//Micronutrients prevent cancer and delay ageing/ Toxicol. Lett.-

102-103.-1998.-5-18.

42. Ames Bruce N. // DNA damage from micronutrient deficiencies is likely/

Toxicol. Lett.-98.-1999.-23-36.

43. Arnold D.L., Boyes B.G. // The toxicological effects of sacharin in short-term genotoxicity assay./ Mut. Res. 1989.V.221.-69-132.

44. Azuine M.A., Goswam U.C., Kagal J.S., Bhile S.V. // Antimutagenic and anticarcinogenic effects of carotenoids and dietary palm oil. / Nutr. Cancer. -1992. - 173.- 287-295.

45. Belisario M.A., Pecce R. et al. // Ingibitioon of cyclofosphamide mutagenicity by beta- carotene. / Biomed. Pharmacother. - 1985. - 39. - 445-448.

46. Bianchi L., Tateo F., Pizzala R. et al. // Carotenoids reduce the chromosomal damage induced by bleomycin in human cultured lymphocytes. / Anticancer Res. - 1993. - 7. - 1007-1010.

47. Blot W.J., J.-Y. Li, P.R. Taylor, W. Guo, S. Dawsey, G.-Q. Wang, C.S. Yang, S.-F. Zheng, M. Gail, G.-Y. Li, Y. Yu, B. Liu, J. Tangrea, Y. Sun, F. Liu, J.F. Fraumeni, Y.-H. Zhang, B. Li// Nutrition intervention trials in Linxian, China: supplementation with specific vitamin/mineral combinations, cancer incidence, and disease-specific mortality in the general population/ J. Natl. Cancer Inst. 85.-1993.- 1483-1492.

48. Bonassi S., L. Hagmar, U. Striirnberg, A.H. Montagud, H. Tinnerberg, A. Forni, P. HeikknX S. Wanders, P. Wilhardt, I.-L. Hansteen, L.E. Knudsen, H.

Norppa// Chromo-somal aberrations in lymphocytes predict human cancer independently of exposure to carcinogens group on cytogenetic biomarkers and health/ Cancer Res.-60.- 2000.- 1619-1625.

49. Bowen P.E., Garg V., Stasewicz-Sapuntzakis M. et al. Ann. NY Acad. Sci.-1994.- 691.- 241-243.

50. Boyonoski A.C., Gallacher L.M. et al.//Niacin deficiency increases sensitivity of rars to the stort and long term effects of treatment/Mol. Cell. Biochem.-193.-

1999.-83-87.

51. Brown E.D., Micozzi M.S., Craft N.E. et al.. Am. J. Clin. Nutr., 1989.-49(6),

1258-1265.

52. Во1ш1 F., R. Edge, L. Lange, T.G. Truscott// Enhanced protection of human cells against ultraviolet light by antioxidant combinations involving dietary carotenoids/ J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 44.-1998.- 211-215.

53. Chatterjee Malay //Vitamin D and genomic stability/ Mutation Research 475.2001.- 69-88.

54. Claycombe Kate J., Meydani S. N. //Vitamin E and genome stability// Mutation Research- 475.-2001.- 37-44/

55. Collins A.R.// Oxidative DNA damage, antioxidants and cancer// BioEssays.-21.-1998.- 238-246.

56. Creppy E.E. et al.// Prevtntion of Nephrotoxiccity Of Ochratoxin A and food contaminant// J. Toxicol. Lett.- 82/83.-1995.- 56-63.

57. Creppy E.E., Baudrimont I. and A.-M. //Haw Aspartame Prevents The Toxicity Of Ochratoxin A/ J. Toxicol. Sciences.- 23(II).-1998.- 689-877.

58. Culter R.G. (1984). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7627-7631.

59. Darroudi F.,Targa H., Natarajan A.T. // Influence of dietary carrot on the cytostatic drug activity of cyclophosphamide and its main directly acting metabolite: Induction of sister-chromatid exchanges in normal human lymphocytes, Chinese hamster ovary cells, and their DNA repair-deficient cell lines./Mutat. Res. - 1988. - 198. - 327-337.

60. Davison A., Ronssean E., Dunn B. // Putative anticarcinogenic action of
carotenoids: nutritional implication./ Can. J. Phisiol. Pharmacol.-1993.-71.-

732-745.

61. De Flora S. // Mechanismus of inhibitors of mutagenesis and carcineyenesis / Mutat.Res., 1998, 402, 151-158.

62. De Flora S. //Mechanisms of inhibitors of mutagenesis and carcinogenesis/ Mutat. Res. - 1992.- 23. -67-73.

63. De Freitas J.M., R. Meneghini //Iron and its sensitive balance in the cell/ Mutation Research.- 475.-2001.

64. Dixon L.B. et al. //Difference in energy, nutrient and food intakes in a US sample of Mexican-American women and men/Am. J. Epidemiol. 152(6).-

2000.-548-557.

65. Dreosti I.E. //Zinc and the gene/ Mutation Research.- 475.-2001.

66. Duthie S.J., A. Ma, M.A. Ross, A.R. Collins// Antioxidant supplementation decreases oxidative DNA damage in human lymphocytes/ Cancer Res. 56.1996.- 1291-1295.

67. Durnev A.D. at el // The influence of two carotenoid food dyes on clastogenic activities of CYPF and DN in mise./ Food and Chem. Toxic.-36.-1998.-1-5.

68. Duthie S.J., A.R. Collins, G.G. Duthie// The role of carotenoids in modulating DNA stability and lipid peroxidation: importance for human health/ Subcell. Biochem.- 30.-1998.- 181-207.

69. El-Bayoumy K.//Protective role of selenium ongenetic damage and on cancer/ Mutation Research.- 475.-2001.

70. Erdman J.W., Bierer T.L., Gugger E.T.. Ann. NY Acad. Sci. -1994.- 691, 7685.

71. Fenech M.// Recommended dietary allowances (RDAs)/ Mutat. Res.-5(1).-

2000.-251-256.

72. Fenech M.//Chromosomal damage rate, ageing and diet/ Ann. NY Acad. Sci.-854.-1998.-23-36.

73. Fenech. M.// The role of folic acid and Vitamin B12 in genomic stability of human cells// Mutation Research 475 (2001) 57-67.

74. Ferguson Lynnette R. //Role of plant polyphenols in genomic stability/ Mutation Research.- 475.-2001.- 89-111.

75. Gasiorowsi K. Et al.// A review of the genotoxicity of marketed pharmaceuticals/ Mutat. Res. 2001, 488, pp. 151-169.

76. Gaveral H., Friedman S., Alberts D., Ramsey L. // Oral cancer prevention : the case for carotenoids and antioxidation nutrients. / Prev. Med. - 1993. - 22.701-707.

77. Giovannucci E.// Selenium and risk of prostate cancer/ Lancet.- 352.-1998.-

755-756.

78. Hageman G.J., Stierum R.N.//Niacin, poly(ADP-ribos)polymerase-1 and genomic stability// Mutation Research.- 475.- 2000.- 36-41.

79. Halliwell B. //Vitamin C and genomic stability// Mutation Research.- 475.2001.- 29-35.

80. Hartman P.E., Shankel D.M// Antimutagens and anticarcinogens: a survey of putative interceptor molecules ./Environ. and Mol. Mutagenes.-1990.- 15.145-182.

81. Hayatsu H., Negishi T., Arimoto S., Hayatsu T. // Porphyrins as potential inhibitors against exposure to carcinogens and mutagens./Mutat. Res. - 1993. -

290.-79-85.

82. Hayatsu H., Sakae Arimoto, Tomoe Negishi.// Dietary inhibitors of mutagenesis and carcinogenesis./ -Mutat.Res.-1988.-202.-429-446.

83. Hennekens C.H., Buring J.E., J.M. Gaziano, Antioxidant vitamins and cardiovascular disease, in: A. Bendich, R.J.// Deckelbaum (Eds.), Preventive Nutrition: The Comprehensive Guide for Health Professionals/ Humanae Press.- Totowa, NJ.- 1996.- pp. 171-180.

84. Heo M.Y., Jae L.H., Jung S.S. 1996

85. Heo M.Y., Lee S.J. et al.// Modification affects Galangin 1994

86. Isler O. Carotenoids. - Basel , 1997.

87. Iwama Y., Nishimura S., Katoh K., Sano K. //Atherosclerosis.-1994.-109.-1,2.-

88. Jacobson E.L., Shiek W.M.//Mapping the role of NAD metabolism in prevention of cancerogenesis/ Mol. Cell. Biochem.-193.-1999.-69-74.

89. Konopacka M., M. Widel, J. Rzeszowska-Wolny// Modifying effect of b-carotene against gamma-ray-induced DNA damage in mouse cells// Mutat. Res.- 417.-1998.- 85-94.

90. Konopacka M., J. Rzeszowska-Wolny// Modifying effect of Vitamins C, E and b-carotene against DNA damage in mouse cells/ Mutat. Res.- 418.-1998.- 5763.

91. Kornhauser A., W.G. Wamer, L.A. Lambert, R.R. Wei// b-Carotene inhibition of chemically-induced toxicity in vivo and in vitro/ Food Chem. Toxicol.- 32.1994.- 149-154.

92. Levander O.A., P.D. Whanger// Deliberations and evaluations of the approaches, endpoints and paradigms for selenium and iodine dietary recommendations/ J. Nutr. 126.-1996.- 2427S-2434S.

93. Lindahl T., Wood R.D.//Quality control by DNA repair/Science.-286.-1999.-

1897-1905/

94. Linder M.C.//Copper and genomic stability in mammals/ Mutation Research.-

475.-2001.

95. Linder M.C.//Copper: in Present Knowledge in Nutrition/ ILSI Press, DC.-

1996.-307-319.

96. Lowe G.M., L.A. Booth, A.J. Young, R.F. Bilton// Lycopene and b-carotene protect against oxidative damage in HT29 cells at low concentrations but rapidly lose this capacity at higher doses/ Free Rad. Res. -30.-1999.- 141-151.

97. Manoharan K., Banerjee I. // Beta-carotene reduces sister chromatid exchanges induced by chemical carcinogens in mouse mammaly cells in organ culture. / Cell Biol. Int. Rep. - 1985. - 9. - 783-789.

98. Martin F., Coli K., Phillips D.// Genotoxicity of human milk extracts and detection of DNA damage in cells recovered from breast milk/ Biochem. Biophis. Res. Commun., 1999, 257(2): 319-320.

99. Mayne S.T. // Beta-carotene, carotenoids and clisease prevention in human. / Faseb J. - 1996. - 10,7. - 690-701.

100. Meyers D.G. // The iron hypothesis — does iron cause atherosclerosis?/ Clin. Cardiol.- 19.-1996.- 925-929.

101. Moller S.E. // Effect of Aspartam and protein, advinistered in pyenylalanine-equivalent doses, on plasma neural/ Pharm. And Tox. 68.-1991.-

408-412.

102. Moon R.C., A.I. Constantinou// Dietary retinoids and caro-tenoids in rodent
models of mammary tumorigenesis/ Breast Cancer Res. Treatment.- 46.-1997.-

181-189.

103. Morris M.C. at. El. //Vitamin E and Vitamin C supplement use and risk of
incident Alzheimer disease./ Alzheimer Disease & Associated Disorders.-

12(3).-1998.-121-126.

104. Olson J.A. . J. Nat. Cancer Inst. -1984.-73(6).- 1439-1444.

105. Omenn G.S., Goodman G.E. et al. //Effects of a combination of beta-carotene and vitamin A on lung cancer disease/ N. Engl. J. Med.-334.-1996.-

1150-1155.

106. Omenn G.S.// Chemoprevention of lung cancer: the rise and demise of b-carotene/ Ann. Rev. Public Health.- 19.-1998.- 73-99.

107. Peto R., R. Doll, J.D. Buckley, M.B. Sporn// Can dietary b-carotene

materially reduce human cancer rates?/ Nature 290.-1981.- 201-208.

108. Polan P.R., Mikalm.S., Basu J., Romney S.L. Nutr. Cancer.- 1991.- 15(1).-

13-20.

109. Preston R.J., Dean B.J., Galloway S. et al// Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells./ Mutat.Res. -1987.-189.- 157-165.

110. Raj A.S., Katz M. // Beta-carotene as an inhibitor of a benzo(a)pyrene and mitomycin C induced chromosomal breaks in the bone marrow of mice. /Can. J. Genet and Cytol. - 1985. - 27. - 598-602.

111. Raj A.S. // Beta-carotene as an inhibitor of mitomycin C induced chromosomal breaks in mice. /Can. J. Genet and Cytol. - 1985. - 26. - 78-86.

112. Ranney et al.// Aspartam status and hematological findings in predominately black elderly persons from urban low-income households/ Am. J. Clin. Nutr. 32.-1976.- 2346-2353.

113. Renner H.W. // Anticlastogenic effect of beta-carotenein Chinese hamster. Time and dose response studies with different mutagens./Mutat. Res.-1985.-

144.-251-256.

114. Renner H.W., Knoll M.//Antimutagenic effects of carotenoids on male germ cells of mice./Mutat.Res.-1984.-140.-127-129.

115. Riso P., A. Pinder, A. Santangelo, M. Porrini// Does tomato consumption effectively increase the resistance of lymphocyte DNA to oxidative damage?/ Am. J. Clin. Nutr.- 69.-1999.- 712-718.

116. Rosenkranz M., Zierler H.//Chromosomenanalysen bei Abortus./ Wien.

Med. Wochenschr.- 1990.-140.-545-547.

117. Saltman P., J. Gurin, I. Mothner, Nutrition Book, The University of California, San Diego, Little Brown &Company, Boston, 1993.

118. Salvadori D.M., Ribeiro L.R., Oliveira M.D. et al. // Beta-carotene as a modulator of chromosomal aberrations induced in mouse bone marrow cells. /

Environ. Mol. Mutagen. - 1992. - 20. - 206-210.

119. Salvadori D.M., Ribeiro L.R., Oliveira M.D. et al. // The protective effect of beta-carotene on genotoxicity induced by cyclophosphamide. / Mutat. Res. -1992. - 265. -237-244.

120. Salvadori D.M.. // Anticlastogenic effects of beta -carotene in mammals. / Rev. Bras. Genet. - 1991. - 14. - 1095-1096.

121. Starvic B.// Biological significance of trace levels of mutagenic heterocyclic aromatic amines in human diet: a critical review./ Food and Chem. Toxicol.-1992.-32.- 977-994.

122. Scott D., Danford N.D., Dean B.J. et al. Cromosome aberration assay in mammalian cells in vitro. // Report of the UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. / Ed. Dean B.J. United Kingdom Environmental Mutagen Society, Swnsea , 1983. - 43-64.

123. Scott D., Galloway S., Marshall R.R. et al. // Genotoxicity under extreme culture conditions. / Mutat. Res. - 1991. - 257. - 147-204.

124. Selhaub J., Bagley L.C.//B vitamins, homocysteine and neurocognitive function in the elderly/ Am. J. Clin. Nutr. 71(2).-2000.-614-620.

125. Shibata A., Sasaki R., Ito Y. et al. (1989). Int. J. Cancer, 44, 48-52.

126. Sies H., W. Stahl, A.R. Sundquist// Antioxidant functions of vitamins: Vitamin E and C, b-carotene and other carotenoids/ Ann. N.Y. Acad. Sci.-669.-1992.- 7-20.

127. Skibola C.F., M.T. Smith, E. Kane, E. Roman, S. Rollinson, R.A.

Cartwright, G. Morgan, Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene are associated with susceptibility to acute leukemia in adults/

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1999.-12810-12815.

128. Smith A.H., Waller K.D. Am. J. Epidemiol.- 1991.- 133(7).- 661-671.

129. Stich H.F., Dunn B.P. // Relationship between cellular level of beta-carotene and sensitivity to genotoxic agents. / Int. J. Cancer. - 1986. - 38. - 713717.

130. Taillemite J.L.// Cytogenetique et troubles de la reproduction./ Contracept.

Fertil.Sex.-1981.-9.-741-744.

131. Tangney Ch.C., Shekelle R.B., Raynor W. et al. Am. J. Clin. Nutr.- 1987.45.- 764-769.

132. Umegaki K., S. Ikegami, K. Inoue, T. Ichikawa, S. Kobayashi, N. Soeno, K. Tomabechi// b-Carotene prevents X-ray induction of micronuclei in human lymphocytes/ Am. J. Clin. Nutr. 59.-1994.- 409-412.

133. Van Rensburg C.E., Tberon A., G.A. Richards et al. // Investigation of the relationships between plasma levels of ascorbate, vitamin E and beta-carotene and frequency of sister-chromatid exchanges and release of reactive oxidants by blood leukocytes from cigarette smokers. / Mutat. Res. - 1989. - 215. - 167172.

134. Waters M.D., Stack H.F., Jackson M.A. //Inhibition of genotoxic effects of mammalian germ cell mutagens/ Mutat. Res. - 1998.-v. 402.- 129-138.

135. Weisburger J.H. // Antimutagenesis and anticarcinogenesis, from the past to the future/ Mutat. Res.-2001.-480.- 23-35.

136. Wilson J.W., C.W. Enns, J.D. Goldman, K.S. Tippett, S.J.Mickle, L.E. Cleveland, P.S. Chahil//Data Tables: Combined Results from USDA's 1994 and 1995 Continuing Survey of Food Intakes By Individuals and 1994 and 1995 Diet and Health Knowledge Survey, USDA/ARS Food Surveys Research Group, Beltsville Human Nutrition Research Center, Riverdale, MD, 1997.

137. Wolterbeek A.P., Roggeband R., van Moorsel C.J., Baan R.A., Koeman J.H., Feron V.J., Rutten A.A. // Vitamin A and beta-carotene influence the level of benzo(a)pyrene-induced DNA adducts and DNA-repair activities in hamster tracheal epithelium in organ culture. / Cancer Lett. - 1995. - 91. - 205-214.

138. Wotkins M.L., Erickson J.D.// Multivitamin use and mortality in a large prospective study/ Am. J. Epidemiol. 152(2).-2000.-149-162.

139. Wаng X-D, Liu Chin-Kum // Diet and Gastric Cancer / Gl Cancer: An International Journal of Gastrointestinal Oncology, 1998.

140. Ziegler R.G. // A review of epidemiological evidence that carotenoids reduce the risk of cancer, J. Nutr. 119.-1989.- 116-122.


	На главную \| В открытую библиотеку

-Переход в полный каталог почтовой службы рассылки диссертаций-